转录组层面上RNA-RNA相互作用（RRI）的研究进展及机遇综述
最近关注CNS的同学们一定对“Phase Separation”这个词相当眼熟。这个单词翻译成中文就是“相变”或“相分离”。对，你没有看错，就是这个物理化学领域的术语。但最近，这个术语在生命科学领域也掀起了“热浪”。因为据不完全统计，从2018年1月到现在，关于该方面的研究已经有20多项工作分别发表在了Science、Nature或Cell上（对这个领域还不知道的同学，赶紧点击这里，先脑补一下哦）。其中Science上的“mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation”这篇文章中就明确提到，RNA及其参与的相互作用是“Phase Separation” 的重要驱动，在生物体的生老病死中都扮演着关键的角色【1】。那么，问题来了，现在RNA相互作用的研究进展如何？都有哪些方法和技术呢？研究的难点又有哪些呢？
近日，来自清华大学张强锋教授的团队在Quantitative Biology期刊上撰文“Advances and challenges towards the study of RNA-RNA interactions in a transcriptome-wide Scale”，回顾和比较了RNA-RNA相互作用检测技术的类型和特点，并总结和讨论了当前相关研究中的一些发现及难点
译文概要
RNA分子作为遗传信息的传递者，能够指导蛋白质的合成。除了这一项基本的功能，越来越多的研究表明，RNA分子能在不同层次上调控生物学过程。其功能模式，主要依赖于和细胞内其他分子的相互作用。比如通过和DNA序列结合调控靶标区域附近基因的表达【3】，在可变剪接过程中snRNA（small nuclear RNA）可识别并结合mRNA前体以剪切掉内含子序列【4】，还可与大量的RNA结合蛋白（RBP，RNA binding protein）结合形成RNP复合体【5】等。
在本文中，我们首先介绍了三类基本的RNA-RNA相互作用检测技术，第一类是基于RNA分子的理化或细胞性质的低通量方法，包括凝胶迁移（EMSA）、表面等离子共振（SRP）、单分子荧光共振能力转移（single molecule FRET）、蔗糖梯度共沉淀和酵母RNA杂交系统等方法（如图1）。该技术虽然能够检测两个RNA分子是否相互作用，准确性较高，但是无法提供具体的作用位点信息。
图1. 基于RNA分子的理化或细胞性质的RNA-RNA相互作用检测技术
第二类是基于测序的高通量靶标方法（如图2）。这类方法主要是先交联上相互作用的RNA，然后通过抗体富集特定蛋白介导的RNA相互作用，如检测AGO蛋白介导的miRNA参与相互作用的CLASH【6】，Hfq蛋白介导的RNA相互作用的RIL-seq【7】和已用于检测与Staufen1蛋白结合的RNA二级结构的HiCLIP【8】；或者通过探针序列富集出靶标RNA参与的RNA相互作用，如RIA-seq【9】和RAP【10】，RAP中更长的探针能够大幅度降低非特异性的相互作用。这类方法是高通量技术最早在RNA-RNA大规模检测上的应用，实现了一对多的相互作用的检测，也能提供具体的相互作用位点信息。
图2. 高通量靶标检测方法
第三类方法是2016年几个小组分别建立的在全转录组水平测定RNA-RNA相互作用的方法（如图3），包括PARIS【11】、SPLSH【12】、LIGR-seq【13】和MARIO【14】。前三个技术引入了AMT小分子及衍生物交联相互作用的RNA，然后富集这些双链RNA用于测序；MARIO则检测所有蛋白介导的RNA相互作用。这些技术建立了不同物种、多个细胞系中的RNA-RNA相互作用图谱，使得RNA-RNA相互作用网络的建立和分析成为可能。
图3. 全转录组水平检测RNA-RNA相互作用的方法
随后，我们按照不同类型的RNA分子，归纳并讨论了不同研究中涉及到的RNA-RNA相互作用。比如，miRNA-mRNA的相互作用是最早实现的大规模分析，主要运用了CLASH技术，揭示了其互补种子区域存在的大量非完美配对；snoRNA可以修饰不同类型的RNA，且其相互作用可以是多位点的。最近的几个技术也都新鉴定出了一些snoRNA参与的相互作用；lncRNA能够与其他RNA相互作用，并招募蛋白，从而调节靶标的表达水平。这些相互作用可以形成一个大的网络。类似于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，RNA-RNA相互作用网络，遵循无尺度的特性，存在少数的RNA分子具有很多的靶标，这些热点（hub）分子对于网络的调控至关重要【15】。网络的聚类分析也表明具有相似功能的RNA倾向于相互作用，在不同的生理条件下也呈现出动态变化。
文章最后，我们讨论了RNA-RNA相互作用研究中存在的一些挑战，主要包括：
1）当前的技术检测到的RNA-RNA相互作用是不饱和的。这个主要受限于实验中交联和连接步骤的效率及测序深度；
2）RNA-RNA相互作用的动态变化。在不同的细胞系、不同的发育时期，RNA相互作用图谱会发生变化，这种变化的意义有待验证和阐明；
3）计算方法的局限性。不同的研究使用的鉴定RNA-RNA相互作用的算法、条件不同，缺乏统一的框架；
4）难以区分非特异性（非功能性）的相互作用。对于鉴定的RNA-RNA相互作用，虽然可以用分子生物学的方法证实其真实存在，但是其对下游生物学事件的影响难以挖掘，需要更多的假设和功能性验证实验。
综上所述，虽然RNA-RNA相互作用研究中存在的一些挑战，但基于已有技术，全转录组范围内的RNA-RNA相互作用图谱得以建立，加深了对于RNA功能模式的理解。作为一种转录后调控的机制，RNA-RNA相互作用和其他的影响因素（比如RNA二级结构、RNA修饰、RBP结合等）之间的关系，需要更加系统性的分析和挖掘。
Reference
1. Langdon, E.M., Qiu, Y., Niaki, A.G., McLaughlin, G.A., Weidmann, C., Gerbich, T.M., et al. (2018) mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation. Science, 360(6391):922-927
2. Gong, J., Ju, Y., Shao, D., Zhang Q. C. (2018) Advances and challenges towards the study of RNA-RNA interactions in a transcriptome-wide scale. Quant Biol., 6: 239
3. Quinn, J. J. and Chang, H. Y. (2016) Unique features of long noncoding RNA biogenesis and function. Nat. Rev. Genet., 17, 47–62
4. Modrek, B. and Lee, C. (2002) A genomic view of alternative splicing. Nat. Genet., 30, 13–19
5. Gerstberger, S., Hafner, M. and Tuschl, T. (2014) A census of human RNA-binding proteins. Nat. Rev. Genet., 15, 829–845
6. Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T. and Tollervey, D. (2013) Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell, 153, 654–665
7.Melamed,S.,Peer,A.,FaigenbaumRomm, R., Gatt, Y. E., Reiss, N., Bar, A., Altuvia, Y., Argaman, L. and Margalit, H. (2016) Global mapping of small RNA-target interactions in bacteria. Mol. Cell, 63, 884–897
8. Sugimoto, Y., Vigilante, A., Darbo, E., Zirra, A., Militti, C., D’Ambrogio, A., Luscombe, N. M. and Ule, J. (2015) hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature, 519, 491–494
9. Kretz, M., Siprashvili, Z., Chu, C., Webster, D. E., Zehnder, A., Qu, K., Lee, C. S., Flockhart, R. J., Groff, A. F., Chow, J., et al. (2013) Control of somatic tissue differentiation by the long noncoding RNA TINCR. Nature, 493, 231–235
10. Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M. and Lander, E. S. (2014) RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell, 159, 188–199
11. Lu, Z., Zhang, Q. C., Lee, B., Flynn, R. A., Smith, M. A., Robinson, J. T., Davidovich, C., Gooding, A. R., Goodrich, K. J., Mattick, J. S., et al. (2016) RNA duplex map in living cells reveals higher-order transcriptome structure. Cell, 165, 1267–1279
12. Aw, J. G., Shen, Y., Wilm, A., Sun, M., Lim, X. N., Boon, K. L., Tapsin, S., Chan, Y. S., Tan, C. P., Sim, A. Y., et al. (2016) In vivo mapping of eukaryotic RNA interactomes reveals principles of higher-order organization and regulation. Mol. Cell, 62, 603–617
13. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D. and Blencowe, B. J. (2016) Global mapping of human RNA-RNA interactions. Mol. Cell, 62, 618–626
14. Nguyen, T. C., Cao, X., Yu, P., Xiao, S., Lu, J., Biase, F. H., Sridhar, B., Huang, N., Zhang, K. and Zhong, S. (2016) Mapping RNA-RNA interactome and RNA structure in vivo by MARIO. Nat. Commun., 7, 12023
15. Gong, J., Shao, D., Xu, K., Lu, Z., Lu, Z.J., Yang, Y.T., Zhang Q.C. (2017) RISE: a database of RNA interactome from sequencing experiments. NAR., 46, D194-D20.
作者简介：
张强峰，清华大学生命科学学院，教授
龚警，清华大学生命科学学院，在读博士
注：原文转载自 QB期刊，如有侵权，请联系小编（微信：pjw6221）删除。